微生物的保存方法很多,根據(jù)不同的微生物菌(毒)株或不同的實驗要求,可選用不同的保存方法,其中常見的有斜面保存法,穿刺保存法、液體石蠟保藏法、沙土管保存法、冷凍保存法、真空冷凍干燥保存法。其中真空冷凍干燥保存法方便復(fù)活、保存期長,運(yùn)輸和保存方便,活菌率高。
冷凍干燥是將菌體懸浮液冷凍到冰點以下,從而轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w結(jié)晶態(tài),然后在低溫低壓(真空)下使固體升華而脫水的干燥方法。一般干燥處理過程會破壞微生物的細(xì)胞膜,引起細(xì)胞的大量死亡,因此需要添加保護(hù)劑,能夠使菌液密度均一,減少活菌在凍干過程中的機(jī)械效應(yīng)和溶質(zhì)效應(yīng)帶來的死亡。因此,在凍干前加入的保護(hù)劑配方就成為了至關(guān)重要的決定性因素,它既會影響到儲存期細(xì)胞的活性以及穩(wěn)定性,也會影響到復(fù)水時細(xì)胞存活率。
凍干法是長期保存細(xì)菌、酵母、真菌、病毒和立克次氏體的標(biāo)準(zhǔn)方法(在凍干前一般要加冷凍保護(hù)劑,這樣可使細(xì)胞免除在冷凍初期因形成冰晶而造成的損害。ATCC 常規(guī)用10%脫脂奶或12%蔗糖作為冷凍保護(hù)劑,而美國農(nóng)業(yè)部(USDA)的農(nóng)業(yè)研究服務(wù)機(jī)構(gòu)的實驗人員用牛或馬血清作為微生物的冷凍保護(hù)劑(。在菌液中加入甘油和二甲亞砜(DMSO)也可防止冷凍中微生物的死亡,但實際操作中應(yīng)根據(jù)不同微生物決定應(yīng)用或不用保護(hù)劑。
真空冷凍干燥法保存菌種的步驟主要包括:
1、微生物培養(yǎng),培養(yǎng)獲得健壯的菌種擴(kuò)培液體。培養(yǎng)時根據(jù)菌種選擇不同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)到對數(shù)期獲得大量健壯的菌種,保證菌體濃度,一般達(dá)到109的濃度.
2、離心收集菌體。通過離心法從液體培養(yǎng)基中獲得菌體。如果是固體培養(yǎng)基可以直接收集菌落,用保護(hù)劑溶解混勻。
3、將菌體、脫脂奶粉、海藻糖、蔗糖等保護(hù)劑在無菌水中混勻得到含有保護(hù)劑的菌體混懸液。
4、分裝。將菌體混懸液在無菌環(huán)境中分裝到無菌容器中,可以是安瓿瓶、西林瓶、EP、培養(yǎng)皿等。
5、預(yù)凍,預(yù)凍是非常關(guān)鍵的。預(yù)凍不好,菌體會死亡。要快速預(yù)凍,防止產(chǎn)生大冰晶造成細(xì)胞死亡。預(yù)凍要凍結(jié)實,保證預(yù)凍充分。
6、將預(yù)凍好的菌體,放入真空冷凍干燥設(shè)備中進(jìn)行凍干。如果是設(shè)備帶預(yù)凍功能,也可以直接在凍干機(jī)上進(jìn)行預(yù)凍。真空冷凍干燥時間和凍干曲線的 設(shè)計要根據(jù)菌種的不同和菌體混懸液的濃度等進(jìn)行設(shè)計。凍干好后真空密封保存。
微生物凍干法采用的凍干設(shè)備可以有多種選擇,從實驗室凍干機(jī)到研發(fā)型凍干機(jī)都可以適用。如以下系列凍干機(jī)都可以用來凍干保存微生物。
型號 | Pilot2-4L | Pilot2-4M | Pilot2-4H |
凍干面積 | 0.2㎡ | 0.2㎡ | 0.2㎡ |
冷阱溫度(空載) | -55℃ | -85℃ | -85℃ |
真空度(空載) | <6Pa | ≤1Pa | ≤1Pa |
板層尺寸(mm) | 375*270 | | |
板層溫度(空載) | -40℃ | -55℃ | -55℃ |
板層制冷方式 | 硅油循環(huán) | 硅油循環(huán) | 硅油循環(huán) |
箱阱結(jié)構(gòu) | 箱阱一體式 | 箱阱一體式 | 箱阱分離式 |
捕水能力 | 4L | 4L | 4L |
凍干效率 | 3L/24H | 3L/24H | 3L/24H |
板層間距 | 80mm | 80mm | 80mm |
壓塞 | 手動 | 手動 | 手動 |
壓縮機(jī)功率 | 7/8HP | 2*7/8HP | 2*7/8HP |
真空泵 | 2L/S | | |
整機(jī)尺寸 (約) | W660*D850*H1440 | W660*D850*H1440 | W660*D960*H1440 |