微生物菌種可以采用凍干法進行保存。凍干法制備的菌種具有保存周期長,易活化,保存存活率高。具體方法步驟如下:
1、準備安瓿瓶用于真空冷凍菌種保藏。安瓿瓶宜采用中性玻璃制造,形狀可用長頸球形底的。大小要求外徑6~7.5mm,長105 mm,球部直徑9~11 mm,壁厚0.6~1.2 mm,也可用沒有球部的管狀安培管。先用2%鹽酸浸泡8~10h,再經(jīng)自來水沖洗多次,用蒸餾水涮洗2~3次,烘干;在每管內(nèi)放入打好菌號及日期的標簽,字面朝向管壁,管口塞好脫脂棉塞,121℃下高壓滅菌20分鐘,備用。
2、準備菌種:用真空冷凍干燥法保藏的菌種保藏期可長達幾年甚至幾十年。為了活性高,保存期長,所用菌種純度要高,而且菌齡要適宜。細菌和酵母菌的菌齡要求超過對數(shù)生長期,若用對數(shù)生長期的菌種進行保藏,其存活期反而降低。一般細菌的菌齡要求24~48h。酵母菌為3d,形成孢子的微生物則宜保藏孢子。放線菌和絲狀真菌菌齡為7~10d。
3、保護劑的選擇和準備:選取新鮮牛奶作為保護劑,牛奶采用脫脂牛奶,用離心方法去除上層油脂,115℃下高壓蒸汽滅菌25min,備用。或者采用微生物專用凍干保護劑配方可以保持更高的活性。我公司針對微生物凍干開發(fā)保護劑,確保微生物高活性凍干。
4、菌種準備及分裝菌種:每支長好的斜面加2~3ml保護劑,用接種環(huán)將菌苔輕輕刮起(注意勿刮起培養(yǎng)基,制成菌懸液。如用液體培養(yǎng)的菌種,則需經(jīng)離心收集和用滅菌生理鹽水洗滌細胞,收集的菌體用保護劑懸浮制成菌懸液。懸液中菌數(shù)要求達到108~1010個/ml為宜。懸液制備完成盡快分裝和凍結(jié)。分裝安瓿時可用滅菌滴入安瓿管底部,每管分裝量約0.1~0.2毫升,分裝安瓿管時間盡量要短,最好在1-2小時內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。分裝時應(yīng)注意在無菌條件下操作。
5、預(yù)凍-80℃冰箱預(yù)凍1~2小時或者在凍干機內(nèi)預(yù)凍3-6個小時。
6、冷凍干燥:將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內(nèi),開始冷凍干燥,時間一般為8-20小時。終止干燥時間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷:①安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀;②真空度接近空載時的極限真空。③選用1-2支對照管,其水份與菌懸液同量,視為干燥完結(jié)。
7、封口抽真空干燥后,取出安培瓶,接在封口用的玻璃管上,可用L形五通管繼續(xù)抽氣,約10min即可達到26.7Pa(0.2mmHg。于真空狀態(tài)下,以煤氣噴燈的細火焰在安培管頸中央進行封口。
8、保藏安瓿管保藏在-20℃冰箱里。
9、凍干法保存的菌種活化:如果要從中取出菌種恢復(fù)培養(yǎng),可先用75%酒精將管的外壁消毒,用鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端,使管子破裂,在安瓿管中加入0.5~1ml液體培養(yǎng)基,慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿管,使凍干菌種復(fù)水,然后直接接種到瓊脂斜面或涂布平板。凍干法保存的菌種方便活化,活性高。